戊酸雌二醇片為雌激素類藥，用于補充自然或人工絕經(jīng)相關(guān)的雌激素缺乏：治療血管舒縮性疾病，生殖泌尿道營養(yǎng)性疾病以及精神性疾病等。戊酸雌二醇片F(xiàn)DA的BE指南亦建議檢測“雌酮(總)”進行等效性評價，并提交雌二醇(未結(jié)合)和雌酮(未結(jié)合)數(shù)據(jù)作為可比治療結(jié)果的支持性證據(jù)。

FDA關(guān)于戊酸雌二醇片的BE指南

  而對于生物等效性評價，準(zhǔn)確定量血藥濃度是至關(guān)重要的。
  分析方法的難點
  難點1內(nèi)源性化合物定量分析
  雌二醇為內(nèi)源性物質(zhì)，無法使用常規(guī)空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進行準(zhǔn)確定量分析，一般采用替代基質(zhì)法。做方法驗證時需有替代基質(zhì)和真實基質(zhì)的質(zhì)控樣品，同時需要做平行性實驗，平行性實驗通過才證明替代基質(zhì)的可行性。

表1人血漿中雌激素濃度參考范圍

  難點2酶解條件
  與葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合是人體內(nèi)類固醇代謝的一個主要途徑。因此生物基質(zhì)中的類固醇都以結(jié)合態(tài)和非結(jié)合態(tài)兩種形式存在。由于缺乏類固醇結(jié)合物的標(biāo)準(zhǔn)對照品，通常采用酶解的方式間接的對類固醇結(jié)合物進行定量分析。不同來源的酶（大腸桿菌、哺乳動物牛肝臟等）具有不同的活性需要優(yōu)化溫育條件，確保測樣時酶解完全。
  難點3定量下限低
  為了準(zhǔn)確定量未知基質(zhì)樣品中化合物的濃度，定量下限需做到pg級（雌二醇與雌酮的定量下限分別為2.000與10.00pg/mL），已報道的檢測方法取樣量較大，約0.3~0.5 mL血漿量，且需要進行衍生化操作復(fù)雜，而復(fù)雜的前處理步驟會增加前處理出錯機率與實驗失敗的風(fēng)險。實驗室通過方法優(yōu)化，采用簡單的一步萃取法提取基質(zhì)中的雌二醇與雌酮，不僅操作簡單，無基質(zhì)效應(yīng)，且通量高，同時降低了血漿用量。
  晶易生物分析實驗室檢測方法優(yōu)勢
  分析方法已成功用于多個項目，ISR合格率≥98%。
  一個分析方法檢測未結(jié)合的雌二醇與雌酮可快速分析大量臨床研究樣本，且靈敏度高，適用于臨床的BE/PK研究。
  使用替代基質(zhì)分析，充分考察替代基質(zhì)的選擇性、穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)和回收率等方面，確保替代基質(zhì)的適用性。
  測樣過程中加入酶解質(zhì)控，確保每批次樣本酶解完全。
  分析方法簡述

圖1雌二醇STD1（2.000pg/mL）色譜圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2雌酮STD1（10.00pg/mL）色譜圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

  同類型項目經(jīng)驗
  酶解/水解項目
  二十碳五烯酸乙酯、依折麥布阿托伐他汀、柑橘黃酮、賽洛多辛、依折麥布......
  內(nèi)源性項目
  蔗糖鐵、維生素K1、柑橘黃酮、丁二磺酸腺苷蛋氨酸、熊去氧膽酸、黃體酮、氨茶堿......
  Pg級定量項目
  氟替卡松，莫米松、東莨菪堿、異丙托溴銨，奧昔布寧、骨化三醇、雌三醇......